Η παλαιοχριστιανική ή πρωτοβυζαντινή περίοδος (4ος-7ος αι.) αρχίζει με την ίδρυση της Κωνσταντινούπολης από το Μ. Κωνσταντίνο στα 330 και τη μεταφορά σε αυτή από τη Ρώμη της έδρας της ρωμαϊκής αυτοκρατορίας. Αυτή η μετατόπιση του κέντρου βάρους στην Ανατολή, καθώς και η θέσπιση του χριστιανισμού ως επίσημης θρησκείας του κράτους, άλλαξαν το πρόσωπο της αυτοκρατορίας, κάνοντας έντονο το θρησκευτικό χαρακτήρα του. Η αλλαγή αυτή έγινε σταδιακά, ενώ η συνέχεια και η επιβίωση στοιχείων της προηγούμενης περιόδου σε όλους τους τομείς διαπέρασε τη ζωή της αυτοκρατορίας. Οι τρεις πρώτες αίθουσες της μόνιμης έκθεσης αναφέρονται στην παλαιοχριστιανική περίοδο και πραγματεύονται ζητήματα μετάβασης από την ύστερη αρχαιότητα στην πρωτοβυζαντινή περίοδο, στην πορεία επικράτησης της χριστιανικής θρησκείας και του θριάμβου αυτής, από τον 4ο έως και τον 6ο αι.

Στην πρώτη αίθουσα, που εγκαινιάστηκε τον Ιούνιο του 1997, προσεγγίζονται η αρχιτεκτονική, ο διάκοσμος, τα λειτουργικά σκεύη και αντικείμενα ενός παλαιοχριστιανικού ναού μέσω του βασικού τύπου της ξυλόστεγης βασιλικής (ορθογώνιο κτίριο με κιονοστοιχίες που το χωρίζουν σε κλίτη, με κόγχη στην ανατολική πλευρά). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα μαρμαροθετήματα, οι πλάκες ορθομαρμάρωσης και τα ψηφιδωτά από τους ναούς του Αγίου Δημητρίου και της Αχειροποιήτου, οι διακοσμήσεις ενθετικής τέχνης από μάργαρο, οι υαλοπίνακες, οι τοιχογραφίες, τα αρχιτεκτονικά μέλη (θωράκια, κιονόκρανα, επίκρανα) και τα λειτουργικά σκεύη.

Ο διάκοσμος των ναών καθοριζόταν σε μεγάλο βαθμό από τις κοινωνικές και οικονομικές συνθήκες των διαφόρων περιοχών. Έτσι, στα μεγάλα αστικά κέντρα η διακόσμηση ήταν πλουσιότερη, ενώ στην περιφέρεια φτωχότερη. Το δάπεδο των ναών στην επαρχία στρωνόταν κατά κανόνα με ψηφιδωτά και οι τοίχοι διακοσμούνταν με τοιχογραφίες, ενώ στους πιο πολυτελείς ναούς συνηθίζονταν μαρμάρινα δάπεδα και εντοίχια ψηφιδωτά και μαρμαροθετήματα.